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Western Blot实验步骤

实验步骤:
1.分别配制 5%浓缩胶和12%分离胶
      12%分离胶10mL     5%积层胶6mL
H2O   3.3mL   H2O   4.20mL
30% Acrylamide   4mL   30% Acrylamide   1mL
pH8.8 Tris HCl(1.5M)  2.5mL   PH6.8Tris HCl(1M) 0.76mL
10%APS   100uL   10%APS   60uL
10%SDS   100uL   10%SDS   60uL
TEMED   7.6uL   TEMED   6uL

分离胶:分离胶配制完毕即可进行灌胶,灌胶结束后使用ddH2O进行液封。当水和胶之间有一条折射线时,说明胶已经凝好。(一般要等1.5h)
积层胶:倒掉分离胶上层的水并用吸水纸吸干,配制积层胶并进行灌胶,插入梳子。积层胶凝固完全后拔掉梳子,准备上样电泳。(一般凝固0.5h以上)

2.电泳:
上样顺序如下:
细胞裂解液15ul  细胞裂解液15ul  预染蛋白Marker 10uL 细胞裂解液15ul 细胞裂解液15ul
  
电泳条件:90V 1.5h 。

3.转印:
电泳结束后,取出胶,剪相应大小的一张硝酸纤维素膜和六张滤纸,将胶、膜、滤纸和海绵放入转印缓冲液中浸透,取夹子,按照“海绵—三层滤纸—胶—硝酸纤维素膜—三层滤纸—海绵”的顺序安装好,每一步都要避免产生气泡,放入转印装置中,使胶靠近负极,膜靠近正极。
转印条件:90mA, 90min。

4.封闭:
膜片置于封闭液(PBS / 5%脱脂奶粉)中,4℃过夜封闭。
取出膜PBST洗三次,每次洗 5 min。

5.一抗孵育:
稀释液为1%的PBS脱脂奶粉
一抗(鼠抗)稀释500倍(说明书上为500-1000倍)。70r/min,室温孵育3h。
PBST洗3次,每次8 min。

6.二抗孵育:
稀释液为1%的PBS脱脂奶粉
使用AP标记的羊抗小鼠的二抗,稀释约30000倍。70r/min,室温孵育2h。
PBST洗3次,每次8 min。

7.显色
按照以下配方配制NBT/BCIP显色液:
NBT原液:NBT 40mg 加0.7%的DMF 1.2mL混匀,4℃避光保存(用铝箔包裹);
对照、待测NBT,各配一组。
BCIP原液:BCIP 20mg加100%的DMF 1.2mL混匀,4℃避光保存(用铝箔包裹)。
显色缓冲液:0.1M Tris HCl ,0.1M NaCl ,50mM MgCl2,pH 9. 5。

使用时BCIP和NBT各10uL加在1mL缓冲液中,EP管中混匀,滴到膜上,避光处显色,5~10分钟。见条带后,水洗,中止显色。

如果是DAB显示的话,其他步骤一样,就是**后一步显示,按照DAB显示试剂盒要求操作就可以了。
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