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western 显影常见现象、原因及解决方案

Western 荧光检测取决于抗原含量—一抗敏感度—二抗敏感度—底物敏感度—显影和定影效率这一系统。我的经历认为确保万无一失的做法是如果看到荧光则压 10~30s,看不到则同时压两张,10~30 min 洗一张,如果无则再补一张,1 h 后洗。再无,则压过夜。共 3 张片,根据每次结果调整。
 
其中两张片子的压法如下描述: 先剪一张比膜长 2~3 厘米的片子(以供贴胶带),然后剪 2 片细小透明胶带贴到片子的左右两边(贴时胶带留一半用于粘到封口膜上),然后将片子压到膜上,并使透明胶带留出的一半粘到封口膜上。这样就固定了**张胶片,就不会因为放、取第二张胶片而使**张移动了。然后放第二张胶片,与**张片子贴在一起就行,注意片子要干燥,压片前用纸擦干封口膜,以避免被底物液体污染导致与下面一张粘在一起。取时用手轻轻拂过就可以把上面片子与下面一张错开了,不要用手抠,否则下面一张也移动了。 在洗下面一张片子时一定要取掉粘在片子上的胶带,否则在胶带的地方会影响显影。荧光经过下面一张胶片会稍微有些衰减,所以下面一张胶片感光稍微比上面一张强一些。
 
现象-- - - - - - - - - - - - - - - - - - --原因 - - - - - - - - - - - - - - - - --- -- -- --- -- ---解决
反影 (白色条带, 黑色背景) ---- -- -1 HRP 过高 (背景较高) - - - - - - - - ---- - - - **少成倍稀释一抗/二抗 (可 4~10 倍)*注 1
显影后膜上条带处变为黄色---- - -2 HRP 过高 (敏感性太高)- - - - - - - - - ---- -**少成倍稀释一抗/二抗 (可 4~10 倍)*注 2
信号弱或无---- - - - - - - - - - ---- 3 HRP 过高引起底物迅速耗竭- - - - - -- - - -**少成倍稀释一抗/二抗 (可 4~10 倍)*注 3
--- - - - - - - - - - - - - - ---- - - - --4 抗体-抗原系统敏感性过低- --- - - - - - - 提高抗体浓度/蛋白上样量*注 4
- - - - - - - - - - - - - - - ---- - - - --5 转膜不充分/过转- -- -- - - -- - - - - ---- -优化转膜条件*注 5
-- - - - - - - - - - - - - - ---- - - - - -6 HRP 或底物活性降低---- - - -- - - -- - ----测试活性或选用敏感底物 *注 6
高背景---- - - - - - - - - - - - - - - -7 HRP 过高 (背景较高) - -- - - - - - - - - - -- **少成倍稀释一抗/二抗 (可 4~10 倍)*注 7
---- - - - - - - - - - - - - - --- - - ----8 封闭时间不足- - - - - - - - - - - -- - - - -- 延长封闭时间 4 度过夜**好*注 8
--- - - - - - - - - - - - - - --- - -- -- -9 抗体与封闭液有交叉----- - - - - - - - - - -更换封闭液 (如 3%BSA 的 TBST)*注 9
--- - - - - - - - - - - - - - - -- - -- - -10 TBST 洗脱不足 - - - - - - - ---- - --- - - -增加洗脱时间、次数、用量*注 10
---- - - - - - - - - - - - - - -- - -- - --11 暴光时间过长 - - - - - ---- - - ------ -- --降低暴光时间*注 11
- - - - - - - - - - - - - - - - -- - - ----12 抗原-抗体浓度过高 - - - - - - -- --- - - - 降低抗体浓度或蛋白上样量*注 12
条带内无显影的白点----------------13 转膜不良(如有气泡在胶-膜之间) -- -- 精细操作*注 13
--- - - - - - - - - - - - - - - -- - - ----14 膜平衡不均/油脂污染- - - - - - - - - - - 按说明书平衡膜/戴手套用平头镊子持膜*注 14
---- - - - - - - - - - -- ------------ -- 15 膜与 X 光片间有气泡- -- - - - - - - - - - --显影前去除气泡*注 15
非特异性条带- - - - - --------- -- - -16 抗体交叉反应- - - - - - - - - - - -- -- - --**少成倍稀释一抗/二抗 (可 4~10 倍)*注 16
- - - - - - - - - - - - - - - --- ---- - - -17 SDS 非特异性结合蛋白条带 - - --- - ---使用无 SDS 转膜液*注 17
散在小圆斑 - - - - - -- - -- -- - - ---18 封闭液有杂质颗粒- -- - --------- ------- 静置牛奶使大颗粒沉淀,仅用上层*注 18
 
*注 1 其具体问题有二:一是背景较高, 二是没有条带. 形成机制为条带处 HRP 很快将底物耗竭,则不发光不使胶片感光而为白色, 周围因背景 HRP 较低而持续发光一段时间使胶片感光为黑色。这种常见于高浓度抗体并且封闭/洗脱不好的情况下。如果没有背景则就是原因 3 的现象。在暗室可以看到条带周围荧光而条带处为暗。如是则要么通过降低抗体解决,要么动作迅速早期未耗竭底物时压片,否则一旦耗竭通过减少压片时间不能解决问题。也可以过一段时间鼿 RP 稍减后重加底物迅速压片。还有另外一种反影现象就是压出条带粗大模糊,但条带中心是空的白色,原因和上面的一样,主要是条带中心耗竭底物引起的,也可以在暗室看到中空的荧光带,但与上面的区别主要在于特异性要好一些,若继续发展则就是原因 3 的现象。其分析和解决同上。
 
*注 2 其原因主要是 HRP 太高超速催化底物生成的产物使膜发黄, 压出的片子可以是正常的或和原因 1 或原因 3 的现象同时存在,只是一种现象,在压过的膜可以看出来(只在加底物后一段时间出现,几小时后可能还会消退,有时甚**刚加底物 1~2 min 就可以看出来,所以要把握时机)。如果没有达到原因 1 和原因 3 的程度,那么这种情况一定能够看到很强的荧光,是一种良好的状态, 是我们所期盼的。如果压出正常片子而不出现原因 1 和原因 3 的现象, 可以不予处理。但因为荧光太强极易导致条带增粗变大,所以也可以不稀释抗体而通过调整压片时间来解决,一般压 10s~30s,甚**可以 3~5s,即时根据结果在暗室调整, 荧光持续时间长的话都可连续压十数张片子而效果良好。但也有这种情况,就是由于 HRP 过强无论怎么减少压片时间条带都依然粗大(如果时间过短如<3s则可因感光不足导致条带太淡,这样就不可取了,但依然是粗大的、非条带的本来面目),那么如果想获得漂亮条带则必须通过降低抗体浓度(减少上样量很不稳定且能力有限,故很少使用)来解决。原因1和3若如是则解决也是一样的。#p#分页标题#e#
 
*注3 这是与1类似但抗体特异性较好时的一种表现,经常与下面的原因4、5、6混淆,特别需要注意。主要出现在HRP极高的情况下,来不及压片就已耗竭底物,往往伴有原因2的现象。可通过加入底物后迅速进入暗室观察荧光确定,也可以根据原因2的现象确定,以区分于原因4、5、6。除非动作迅速早期未耗竭底物时压片,否则一旦耗竭通过减少压片时间不能解决问题。也可以过一段时间待HRP稍减后TBST简单洗膜重新加底物压片。这种情况下一/二抗稀释可高达 10 倍而依然荧光明显。
 
*注4 提高抗体上样量以及下述的使用敏感底物/延长压片时间比较简单, 在此不赘述,只提醒一下随抗体浓度增高背景和非特异性可能会增加。关于上样量的极限在此发表我的看法:对于裂解的混合蛋白以上样孔底面积(平方毫米)乘30ug作为极限上样量,而落实到每一个具体条带(同一分子量的所有蛋白或仅做单一蛋白电泳),则以0.3ug/平方毫米底面积作为极限上样量。(见《抗体技术实验指南》的免疫印迹一章),超过此量可能会导致条带变形。条带信号弱可以通过加大上样量/提高抗体浓度/使用敏感底物/延长压片时间解决。但实际上样量的极限并不以我说的极限上样量为准,因为这个极限上样量是确保所有分子量的条带都跑的很漂亮的极限, 而上样超量的表现是随量的加大变形的条带由低分子量逐渐往高分子量延伸。所以western极限上样量的真正操作标准是以目的条带不变形作为极限。比如对于150kd,完全可以超出我所说的极限上样量的2倍而不变形(此时中低分子量条带早已融合或挤为棒槌形了)
 
*注5 对于非小分子量尤其是大分子量(>100kd)蛋白而言,一般不会出现过转情况,转膜不充分是主要原因,增加转膜力度无非是加大电压/电流,延长时间。但对于小分子蛋白(<30kd 就要注意了,<15kd 尤其要当心)很可能出现过转,丽春红染膜或观察 marker 有没有穿膜可以确认,没有丽春红也可以考染转膜后的胶,如果是一片空白,则要小心了,可适当降低转膜力度。对于低分子量一般转膜液不要加 SDS 以防过转,《抗体技术实验指南》提供的针对中低分子量的湿转缓与高分子量的相比也是不含 SDS 的。
 
*注 6 测试 HRP 或底物活性:于暗室 EP 管加底物 A、B 液各 500ul,加入 1ul HRP 偶联二抗,若底物立即发出蓝光并于随后数分钟内消失说明 HRP 和底物尚好。此外试剂公司还开发一些超级底物,其敏感度可达到 pg 级,但价格昂贵,对某些表达较低的蛋白效果会好些,而且也超级省抗体(其推荐抗体稀释比高达1:10,000 以上)。我用的是敏感度为 ng 级的底物,大部分 western 都还可以,pg 级的还放在手里,没舍得用。
 
*注 7 高背景原因是因为 HRP 偶联二抗结合到膜上,其原因包过直接结合、通过膜上蛋白间接结合、通过一抗(主要指多抗中的杂抗体)间接结合、通过封闭物(与封闭物交叉反应)间接结合、洗脱不彻底等原因造成的。在稀释抗体降低背景的同时也会降低对目的蛋白的结合效率,意即以牺牲信号强度为代价。不过在此提出另外一种和稀释抗体恰相反的做法——提高抗体浓度。这种办法适用于 HRP 结合到膜上较多而且底物相对极其敏感(如 pg 级底物,因极其敏感可把结合到膜上的极其微量抗体产生的背景也显示出来,而这种背景在 ng 级底物即使压片过夜也没有显示),无论如何稀释抗体和加强洗膜都不能消除背景或者条带和背景随稀释呈等比例递减甚**条带递减速度比背景还快,如果稀释抗体则压片时间需延长而背景反而因此更加明显。这种情况下认为需要提高抗体含量以提高条带显示程度,而背景随抗体浓度提高并不加强的很厉害,如是则可以通过减少压片时间而达到突出条带降低背景的目的(我**近带一个研究生使用 pg 级超级底物时发现此现象并使用此方法解决背景高的难题,当时一抗稀释为原来的 4 倍,二抗稀释为原来的 10 倍,即总稀释为原来的 40倍仍然可以看到背景的荧光但条带的荧光却减了许多导致条带和背景都无法区分了,后来回复原来浓度并稍微延长孵育时间则条带荧光明显盖过背景并减少压片时间** 5s 解决)。
 
*注 8 这一点似乎多数人都不重视,所以有时候会有些意外。我一般室温 2~4 h,但 4 度过夜确实是**好的。另外在平皿中摇似乎比封口膜更容易掌握并获得较好的效果,对新手似乎更好。
 
*注 9 实际上牛奶对于多数抗体来说还是很好的,但所有二抗也都写着:与牛奶可能有交叉反应。BSA 蛋白单一,可降低因牛奶其他成分引起的背景。单用 TBST 也可以,此法虽然减少了交叉,但单就封闭能力而言却也因此而降低。
 
*注 10 一般 10 min*3 次就足够了,如果不放心可按自己意志加强时间、次数、洗脱液用量。
 
*注 11 以牺牲敏感度为代价其**低标准是使目的条带能够正常显影,对一切原因有效,但效果局限。
 
*注 12 以牺牲敏感度为代价其**低标准是使目的条带能够正常显影,仅对膜上蛋白和一抗引起的有效。
 
*注 13 主要是气泡在胶-膜之间引起的绝缘区使蛋白无法通过而不能到达膜上,这一步在操作时尤其要小心,我自己犯过,也看到其他人犯过。我的办法是把胶铺到膜上,先使其一边接触膜的一边,这样就会在胶和膜交界的地方形成一个水相前缘,然后慢慢落下凝胶,这样这个水相前缘就会逐渐推进直**胶膜重合,如是则不会有气泡产生。把胶铺到膜上而非相反是因为胶是透明的,可以看到水相前缘以及有无气泡产生。#p#分页标题#e#
 
*注 14 膜平衡不均或有油脂污染的表现是膜上有疏水的通明色和蛋白几无(丽春红染),这点并不多见。
 
*注 15 这一点我是抄 pierce 的说明书的,我没遇到过,膜与 X 光片间有气泡也不影响荧光通过,这个我可以肯定。似乎不透明的东西才会导致。
 
*注 16 非特异性条带在普通多抗比较多见,纯化多抗会好的多,但单抗也不是**没有,我也遇到过。关于 wetern 的抗体选择在此提出我的观点:**理想的是混合单抗,其次是纯化多抗,单抗和多抗各有局限和特点,根据个人对特异性需求和蛋白的稳定性而定。

考虑的参数主要是抗原表位和特异性两个因素,不包含每个抗体价格。混合单抗虽然针对多个表位但代价太高,需购置多个单抗然后混合,很少有人这么做。纯化多抗基本具有混合多抗的性质和优点,表位多,稳定性好,特异性也不差,我觉得是实际中的**。单抗虽然特异性好,但如果其针对的表位在提取蛋白时被破坏则其敏感度为会下降甚**为 0,故不稳定。普通多抗虽然表位多,但因含其他抗体,特异性差了好多,会有很多杂带乃**背景。实际我做的抗体多数都是普通多抗,只要封闭的好,效果还是很不错的;单抗虽说不稳定,但实际中我都能做出来,尤其是内参,强烈推荐只选单抗。
 
*注 17 此点我根本不知道,完全是拷贝 pierce 说明书的。
 
*注 18 主要原因是牛奶里面会有一些不悬浮的大颗粒,这些东西对封闭无益。我所有的牛奶全是配好后在 4 度静置(**好放在尖底的管子内),这样那些大颗粒就会沉淀到底部,吸取时不要担心牛奶不均而特意混匀,我只吸上面的,下面的颗粒则不要取。如是则在也没有遇到这种现象。不推荐过滤牛奶,因为耗时极长且得率极低。我用过几次但后来废弃了这种做法。
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